Molecular Cell:研究揭示MLL家族蛋白具有不同产物特异性的分子机制

  赖氨酸甲基转移酶催化底物发生甲基化是一类经典的多步催化反应,赖氨酸可以被加上一个、两个、或三个甲基。同一位点不同程度的甲基化状态一般被视为不同的化学修饰标记,发挥着不同的生物学功能。其中最典型的例子是组蛋白H3K4的单、双、三甲基化。在哺乳动物体内,H3K4的三甲基化(H3K4me3)通常分布在转录起始位点(TSS)附近,和转录激活息息相关;H3K4的单甲基化(H3K4me1)则通常位于增强子区域,作为增强子的典型标记。

  H3K4不同程度的甲基化为何有不同的基因组分布?一般认为和甲基转移酶的基因组定位和它们催化不同甲基化产物生成的酶活特性(产物特异性)密切相关。H3K4甲基化在体内主要是由MLL家族甲基转移酶催化的。在哺乳动物中,有6个具有甲基转移酶活性的MLL家族蛋白成员,包括MLL1,MLL2,MLL3,MLL4,SET1A和SET1B。尽管都源于酵母中相同的祖先Set1,但不同的MLL家族蛋白在细胞命运决定中发挥着重要且非冗余的功能。过去大量体内外研究表明不同的MLL家族成员具有不同的产物特异性,即生成单、双、三甲基化产物的能力不同,但如何准确界定不同MLL蛋白的产物特异性,仍缺乏一个可靠的判断标准。

  早在2003年,就有研究者提出了“F/Y switch”模型用以解释甲基转移酶的产物特异性。该模型认为,SET催化结构域活性口袋的一个关键氨基酸残基,决定了甲基转移酶的产物特异性。具有酪氨酸(Y)残基的甲基转移酶,一般只能催化单甲基化,而具有苯丙氨酸(F)残基的甲基转移酶,可以催化双甲基化或者三甲基化。但目前的“F/Y switch”规则仍无法区分二甲基和三甲基转移酶,并且无法解释MLL家族不同的产物特异性。MLL家族蛋白的活性口袋具有完全一致的F/Y switch残基,却呈现了不同的产物特异性,其背后的分子机制一直是领域内悬而未决的问题。

  中科院分子细胞科学卓越创新中心的陈勇团队、华东理工大学的全舒团队、大连化学物理研究所的李国辉团队、国家蛋白质科学中心(上海)的刘志军、彭超合作,在 Molecular Cell 期刊发表了题为:Structural basis for product specificities of MLL family methyltransferases 的研究论文,揭示了MLL家族成员具有不同产物特异性的结构基础和分子机制。

  

  在该研究中,研究团队系统地比较了MLL家族复合物的产物特异性。他们发现,所有的MLL复合物都可以在短时间内单甲基化未修饰的H3。大部分MLL复合物可以继续把单甲基化的H3进一步甲基化生成二甲基化产物,随着时间的延长,MLL1,MLL2,SET1A,SET1B复合物则可以更进一步产生三甲基化的产物。这些现象说明,单从某个具体的时间节点检测单、双、三甲基化产物的生成来定义甲基转移酶的产物特异性是不准确的,所观察到的产物生成情况与酶浓度、酶的活性、产物特异性等多种因素相关,因此需要综合考虑各级甲基化的反应速率来定义MLL的产物特异性。

  进一步,研究团队建立了Methyl-Quant WB,Methyl-Quant LC–MS/MS和Methyl-Quant MALDI-TOF MS三种定量方法,用来表征MLL复合物催化单、双、三甲基化反应的动力学差异。通过测定不同MLL复合物催化底物发生单、双、三甲基化的速率常数k1,k2,k3及比较各级反应速率之间的差距,研究人员将MLL1/MLL2定义为非连续的二甲基转移酶,MLL3/MLL4定义为单甲基转移酶,而SET1A/SET1B是非连续的三甲基转移酶。利用这些测活系统,研究人员进一步发现产物特异性主要由最小的MLL-RBBP5-ASH2L三元复合物决定,其他的亚基如DPY30等主要影响酶活速率而不影响产物特异性。

  为了进一步探讨产物特异性的分子机制,研究人员综合利用X-射线晶体学,19F-NMR和分子动力学计算模拟表征了MLL家族蛋白活性口袋两个F/Y switch关键酪氨酸残基的空间构象和动态性。他们发现,不同MLL家族蛋白中的关键酪氨酸残基的构象基本一致,但是却表现出了不一样的动态性。对于第一个关键酪氨酸残基(Y1),动态性SET1B>MLL1>MLL3,所以SET1B和MLL1可以克服Y1的空间位阻,利于发生H3K4me1到H3K4me2的过程,而MLL3中的Y1相对固定不利于二甲基化反应的进行。对于第二个关键酪氨酸残基(Y2),动态性SET1B>MLL1,所以SET1B更容易克服Y2的空间位阻,利于催化产生H3K4me3。这一分子机制也可以推广到其它的甲基转移酶,比如F/Y switch的动态性可以用于区分二甲基转移酶GLP和三甲基转移酶DIM5。

  综上所述,这项工作提出,在级联反应中,不同步骤之间的速率比(k1/k2和k2/k3),而不是绝对反应速率,是定义组蛋白甲基转移酶产物特异性的定量标准。这项工作揭示了关键氨基酸的动态性在甲基转移酶催化进程中的重要作用,为进一步了解组蛋白甲基化的动态调控机制奠定了基础。根据这个工作,人们将来可以通过点突变改变组蛋白甲基转移酶的产物特异性,用以阐明不同状态的甲基化修饰在各种生命活动中的重要功能。

  

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